维持体内K⁺/Na⁺平衡是植物适应盐胁迫环境的一个关键手段, 利用先进技术手段和转基因技术, 人们对其机制开展了大量有益的探索研究, 发现植物一方面通过限制Na⁺的进入和增加Na⁺的外排或区隔化, 以减少体内或细胞质中的Na⁺浓度, 另一方面限制体内K⁺流失, 从而实现体内K⁺/Na⁺平衡(Chao et al., 2013; Feki et al., 2014)。早期的研究结果显示细胞质中的Na⁺外排主要由质膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(SOS1)负责, 并由H⁺-ATPase酶负责提供驱动力, 同时引起细胞膜电位重新极化, 减少Na⁺的流入(Shi et al., 2000, 2003; Maathuis, 2006)。另外, K⁺的吸收会受到Na⁺的竞争性抑制, 并且诱导通过外向K⁺通道而外流的K⁺增加(Demidchik & Maathuis, 2007; Britto & Kronzucker, 2008; Shabala & Cuin, 2008)。同时, 有研究显示在盐胁迫下大麦(Hordeum vulgare)和小麦(Triticum aestivum)耐盐型品种根系的K⁺外流量均小于盐敏感型品种(Chen et al., 2005; Cuin et al., 2008)。因此, 了解植物根系区域Na⁺和K⁺离子流情况, 对于理解植物耐盐能力非常重要。

沙枣(Elaeagnus angustifolia)是胡颓子科胡颓子属的落叶小乔木, 主要分布于我国西北五省, 在北京、天津和山东等地也开展了引种栽培, 具有耐旱、耐盐碱和抗风沙的特性, 能提高土壤肥力, 改善土壤环境, 已经被列为半干旱地区和盐土地防护林带的重要树种(郭丽君和王玉涛, 2008; 管文轲和徐娜, 2012; 杨升等, 2014)。大量的研究结果显示, 沙枣幼苗在盐胁迫下, 根、茎和叶片中Na⁺含量增加, 而K⁺含量减少(张宝泽等, 1992; 刘宝玉, 2007; 刘正祥等, 2014)。前期研究也发现, 沙枣幼苗随着NaCl浓度的增加, 根、茎和叶中的Na⁺含量显著增加, 而K⁺含量显著减少, 并且阿拉尔种源沙枣幼苗与银川种源幼苗间存在显著性差异, 阿拉尔种源沙枣幼苗能积累更多的Na⁺在根中, 而叶片中Na⁺含量较少, K⁺含量在NaCl胁迫下的降幅也低于银川种源(杨升等, 2014, 2016)。但是这些结果都是植株在试验中积累下来的一个总体含量, 是静态的, 而研究探讨盐胁迫下Na⁺和K⁺在沙枣体内具有怎样的动态运移机制, 并且比较不同种源间的差异, 有利于进一步理解沙枣的耐盐机制。因此, 本研究选取沙枣银川种源(YC, 盐敏感型)和阿拉尔种源(ALE, 耐盐型)水培苗为试验材料(杨升等, 2015, 2016), 采用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technology, NMT)研究: (1)在150 mmol·L^-1 NaCl胁迫24 h后, 沙枣幼苗根系Na⁺和K⁺的稳态离子流; (2) 150 mmol·L^-1 NaCl瞬时处理, K⁺和H⁺离子流的动态特征; (3)盐胁迫下, 分别用阿米洛利(Na⁺/H⁺逆向转运体抑制剂, Amiloride) 和氯化四乙胺(K⁺通道抑制剂, TEA)处理后, Na⁺和K⁺的离子流特性, 以期从离子动态转运方面探讨沙枣耐盐机制和沙枣种源间K⁺/Na⁺平衡的调控差异, 为进一步发掘优良耐盐沙枣种质资源提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2012年10月下旬, 分别从新疆阿拉尔和宁夏银川采集50株沙枣母树上的成熟果实。处理后, 12月上旬将饱满无虫眼沙枣种子沙藏。次年3月上旬于温室内, 采用四分法, 将沙藏后的种子置于塑料盆中, 并用塑料膜遮盖。第二天(萌芽率达70%), 将沙枣种子播种于营养钵(10 cm × 10 cm, 口径×高)中, 基质为蛭石。期间, 浇洒改良的Hoagland营养液, 注意病虫害防治。当幼苗生长到8-10片叶龄、株高约10 cm时, 取长势基本一致的幼苗, 洗净根部蛭石, 置于塑料花盆(40 cm × 35 cm × 15 cm, 长×宽×高)中开展水培, 80株/种源, 花盆中全天通气。在长出新根之前用自来水培养, 2天换一次水, 之后用1/4 Hoagland营养液培养(蒸馏水配制), 3天换一次营养液。

1.2 试验设计

1.2.1 稳态离子流测定

水培20天后, 每个种源各选取24株大小、长势基本一致的苗木, 其中, 每个种源中16株用含 150 mmol·L^-1 NaCl的1/4 Hoagland营养液培养24 h, 8株作为对照。然后进行Na⁺和K⁺的稳态离子流动态变化测定, 测量10 min。

1.2.2 离子动力学测定

水培19天后, 每个种源挑选大小、长势基本一致的沙枣幼苗16株。测量5-6 min后, 加入NaCl溶液(此时测试液中NaCl浓度为150 mmol·L^-1), 然后继续测定沙枣根尖K⁺和H⁺的动力学离子流30-35 min。

1.2.3 离子流药理学测定

水培20天后, 每个种源选取大小、长势基本一致的沙枣幼苗32株, 其中, 每个种源中24株用含 150 mmol·L^-1 NaCl的1/4 Hoagland营养液培养24 h, 8株作为对照。分别用100 µmol·L^-1 Amiloride (Kong et al., 2012)和20 mmol·L^-1 TEA (Wegner et al., 2011)处理NaCl胁迫24 h后的根系30 min, 再测定根尖的Na⁺和K⁺的离子流。

1.3 试验方法

1.3.1 离子流测定的前期准备

在美国扬格(旭月北京)测试中心利用NMT (NMT100 Series, Younger USA LLC, Amherst, USA)测定盐胁迫下根尖Na⁺、K⁺和H⁺的离子流特性(孙健, 2011; Kong et al., 2012)。所用测试液: 0.1 mmol·L^-1 KCl, 0.1 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.1 mmol·L^-1 CaCl₂, 0.5 mmol·L^-1 NaCl, 0.2 mmol·L^-1 Na₂SO₄, 0.3 mmol·L^-1 2-N-吗啉代乙烷磺酸二水(MES), pH 6.0。前期试验确定了沙枣幼苗根系的最佳扫描位置距根尖顶端为600 μm (对照)和450 μm (150 mmol·L^-1 NaCl)(刘正祥, 2013)。

1.3.2 离子流测定的实验方案

稳态离子流测定(孙健, 2011; 刘正祥, 2013): 选取大小、部位基本一致的嫩根, 剪取3-4 cm的完整根尖, 先用去离子水冲洗干净, 再在测试液中平衡30 min。然后, 固定在培养皿中, 定点测量根尖Na⁺和K⁺的离子流, 待离子流基本稳定后, 测量 10 min, 每处理水平测量6条根尖(即6次重复)。

离子动力学测定(孙健, 2011; 刘正祥, 2013): 剪取3-4 cm的完整根尖, 先用去离子水冲洗干净, 再在测试液中平衡30 min。然后, 固定在培养皿中, 测量K⁺和H⁺的离子流, 待稳定测量5-6 min后, 加入一定量的NaCl溶液(pH 6.0), 使测试液中NaCl浓度为150 mmol·L^-1, 再定点测量K⁺和H⁺的离子流30-35 min, 每个种源测量6条根尖。由于扩散效应, 加入NaCl后的前3 min数据给予剔除。

离子流药理学(Kong et al., 2012): 选取大小、部位基本一致的嫩根, 剪取3-4 cm的完整根尖。先冲洗干净, 然后, 对照和盐胁迫离子流测定用基本测试液平衡30 min, 而用于药理学离子流测定的根尖用含Amiloride或TEA的基本测试液平衡30 min。平衡后, 固定在培养皿中, 测定根尖相应位置(对照为600 μm, NaCl处理为450 μm) Na⁺和K⁺的离子流, 持续测定10 min。

1.4 数据处理与分析

测得的离子流数据先导入Excel表格中, 剔除异常数据, 然后利用Mageflux软件计算离子流速。用Microsoft Excel 2003软件整理数据和制图, 运用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析和最小显著性差异法多重比较(p < 0.05)。

2 结果和分析

2.1 NaCl胁迫对沙枣幼苗根系稳态离子流的影响

2.1.1 稳态Na⁺流

从图1可以看出, 在对照条件下, 两个种源沙枣幼苗根系的Na⁺流均为外流, 其净流量均低于 200 pmol·cm^-2·s^-1, 两个种源间无显著性差异, 而在150 mmol·L^-1 NaCl胁迫处理24 h后, 与对照相比, 沙枣根系的Na⁺外流的净流量显著增加, 并且两个种源间差异明显。NaCl胁迫下, 阿拉尔种源根系Na⁺外流的净流量显著高于银川种源, 分别为912和720 pmol·cm^-2·s^-1。由此说明, 盐胁迫下, 沙枣幼苗根系Na⁺的外排能力显著提高, 并且与银川种源相比, 阿拉尔种源沙枣幼苗表现出更强的排Na⁺能力。

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图1   NaCl胁迫对两个种源沙枣幼苗根系稳态Na⁺流的影响(平均值±标准误差, n = 4)。ALE, 阿拉尔; YC, 银川。不同小写字母表示不同处理和种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 1   Effects of NaCl stress on steady-state Na⁺ flux at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia (mean ± SE, n = 4). ALE, Alaer; YC, Yinchuan. Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments and provenances (p < 0.05).

2.1.2 稳态K⁺流

K⁺是植物代谢过程中的重要物质, 限制体内Na⁺积累, 减少体内K⁺流失, 可以提高植物耐盐性(Gouiaa et al., 2012)。如图2所示, 在对照条件下, 银川和阿拉尔两个种源沙枣根系在对照条件下K⁺外流的净流量仅分别为180和159 pmol·cm^-2·s^-1, 而在150 mmol·L^-1 NaCl胁迫下, 两个种源沙枣根系K⁺外流的净流量显著增大, 分别为469和360 pmol·cm^-2·s^-1,并且银川种源沙枣幼苗K⁺外流净流量明显高于阿拉尔种源, 这表明NaCl胁迫能够激发沙枣根系中K⁺外流, 并且银川种源沙枣幼苗根系保留K⁺能力弱于阿拉尔种源。

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图2   NaCl胁迫对两个种源沙枣幼苗根系稳态K⁺流的影响(平均值±标准误差, n = 4)。ALE, 阿拉尔; YC, 银川。不同小写字母表示不同处理和种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 2   Effects of NaCl stress on steady-state K⁺ flux at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia (mean ± SE, n = 4). ALE, Alaer; YC, Yinchuan. Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments and provenances (p < 0.05).

2.2 NaCl胁迫对不同种源沙枣幼苗根系离子流动力学的影响

2.2.1 瞬时K⁺流的动态特性

由图3可知, NaCl胁迫前, 两个种源沙枣幼苗根系K⁺流表现出平稳的轻微外流。在瞬时加入NaCl (150 mmol·L^-1)后, 沙枣幼苗根系K⁺的外流立刻显著增加, 但是外排强度和变化趋势种源间存在差异。加入NaCl后, 银川种源沙枣幼苗根系的K⁺外排始终高于阿拉尔种源, 并且在10-17 min间, 银川种源K⁺的外流逐渐增加, 其最大值为701 pmol·cm^-2·s^-1, 随后呈缓慢下降趋势, 而NaCl诱导阿拉尔种源K⁺外排在前5 min内呈现出下降趋势, 最终维持在200- 320 pmol·cm^-2·s^-1。这说明在受到NaCl刺激后, 沙枣幼苗根系的K⁺外流立刻显著增加, 引起K⁺损失, 并且阿拉尔种源沙枣幼苗根系的保留K⁺能力强于银川种源。

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图3   NaCl胁迫诱导两个种源沙枣幼苗根系瞬时K⁺流的动态差异(平均值±标准误差, n = 4)。不同小写字母表示同一时间点种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 3   Differences of NaCl stress on transient K⁺ kinetics at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia (mean ± SE, n = 4). Different lowercase letters indicate significant differences between provenances at the same time (p < 0.05).

2.2.2 瞬时H⁺流动态特性

由图4可知, 两个种源沙枣幼苗根系的H⁺净流量在NaCl胁迫前呈现出轻微的内流, 但NaCl胁迫诱导后, H⁺流马上由内流转为外流, 并且阿拉尔种源的H⁺外流大于银川种源。随着时间的延长, 沙枣幼苗根系的H⁺净流量逐渐下降, 大约胁迫15 min后, H⁺净流量趋于平稳, 但阿拉尔种源根系维持在6.38-9.41 pmol·cm^-2·s^-1之间, 高于银川种源(2.21- 5.50 pmol·cm^-2·s^-1), 并且随着时间延长, 差异越来越明显。由此说明, NaCl胁迫能够诱导沙枣根系的H⁺外流, 并且耐盐型沙枣种源的外流量大于盐敏感型种源, 进而表明耐盐型沙枣种源根系具有更强的质子泵活性, 由此抑制膜电位去极化, 减少K⁺流失。

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图4   NaCl胁迫诱导两个种源沙枣幼苗根系瞬时H⁺流的动态差异(平均值±标准误差, n = 4)。不同小写字母表示同一时间点种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 4   Differences of NaCl stress on transient H⁺ kinetics at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia (mean ± SE, n = 4). Different lowercase letters indicate significant differences between provenances at the same time (p < 0.05).

2.3 NaCl胁迫下两个种源沙枣幼苗根系离子流的药理学特性

2.3.1 两个种源沙枣幼苗根系在不同处理下的Na⁺流

如图5所示, 银川种源和阿拉尔种源沙枣幼苗根系在各处理下, Na⁺净流量均为外流, 在对照条件下, 外流量最小, 而NaCl胁迫下最大。在TEA和Amiloride处理后, Na⁺的净流量均显著减少。同时, Amiloride作为Na⁺/H⁺逆向转运蛋白抑制剂, 对Na⁺外流的限制作用比K⁺通道蛋白抑制剂TEA显著。在NaCl胁迫下, 阿拉尔种源的Na⁺净流量处于1β000-1β200 pmol·cm^-2·s^-1之间, 而银川种源则维持在800-1β000 pmol·cm^-2·s^-1。在NaCl + Amiloride处理后, 银川种源的Na⁺净外流量仍然显著低于阿拉尔种源, 与仅NaCl处理相比, 分别下降了 449 pmol·cm^-2·s^-1和429 pmol·cm^-2·s^-1。在NaCl + TEA处理后, 沙枣幼苗根系的Na⁺净流量在阿拉尔和银川种源间差异不明显, 分别为775和727 pmol·cm^-2·s^-1。进一步说明在NaCl胁迫下, 阿拉尔种源沙枣幼苗质膜Na⁺外排能力强于银川种源。

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图5   两种抑制剂对NaCl胁迫后两个种源沙枣根系Na⁺流的影响(平均值±标准误差, n = 4)。ALE, 阿拉尔; YC, 银川。不同小写字母表示同一种源不同处理间差异显著(p < 0.05); 不同大写字母表示相同处理不同种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 5   Effects of two kinds of inhibitors on net Na⁺ flux at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia treated by NaCl stress (mean ± SE, n = 4). ALE, Alaer; YC, Yinchuan. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments in the same provenance (p < 0.05), While different capital letters indicate significant difference between provenances at the same treatment (p < 0.05).

2.3.2 两个种源沙枣幼苗根系在不同处理下的K⁺流

如图6所示, 在各处理下, 银川和阿拉尔种源沙枣幼苗根系的K⁺净流量均呈现出外流, K⁺净流量在对照条件下分别仅为117和87 pmol·cm^-2·s^-1, 当NaCl胁迫24 h后, 分别增加到859和560 pmol·cm^-2·s^-1。当加入抑制剂处理后, K⁺的外流均显著减少, 而Amiloride的抑制效果弱于TEA。在NaCl和NaCl+ Amiloride处理条件下, 银川种源沙枣幼苗根尖的K⁺净流量均明显高于阿拉尔种源, 而在CK和NaCl+ TEA处理下, 两个种源间无明显差异。表明NaCl胁迫环境可以引起沙枣体内K⁺的流失, 银川种源沙枣幼苗根系保留K⁺的能力弱于阿拉尔种源, 并且K⁺通道蛋白和Na⁺/H⁺逆向转运体活性能影响质膜上的K⁺运移。

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图6   两种抑制剂对NaCl胁迫后两个种源沙枣根系K⁺流的影响(平均值±标准误差, n = 4)。ALE, 阿拉尔; YC, 银川。不同小写字母表示同一种源不同处理间差异显著(p < 0.05); 不同大写字母表示相同处理不同种源间差异显著(p < 0.05)。

Fig. 6   Effects of two kinds of inhibitors on net K⁺ flux at apical regions of two provenances of Elaeagnus angustifolia treated by NaCl stress (mean ± SE, n = 4). ALE, Alaer; YC, Yinchuan. Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments in the same provenance (p < 0.05), While different capital letters indicate significant difference between provenances at the same treatment (p < 0.05).

3 讨论

植物维持细胞溶质中较高的K⁺/Na⁺是评判植物耐盐性的一个重要因素, 植物主要通过限制Na⁺吸收, 增加Na⁺外排和区隔化, 以及控制K⁺外流量来实现较高的K⁺/Na⁺ (Maathuis & Amtmann, 1999; Chen et al., 2007a; Cuin et al., 2012)。有研究发现, 耐盐性较强的品种在盐胁迫下具有更强的外排Na⁺能力或保留K⁺能力(Chen et al., 2007b, 2008; Cuin et al., 2008; Sun et al., 2009)。但是也有研究显示K⁺外流不能预测不同基因型水稻(Oryza sativa)的耐盐性(Coskun et al., 2013)。在本试验中, NaCl胁迫后, 沙枣幼苗根系的稳态Na⁺和K⁺外流量均显著增加, 并且耐盐型沙枣种源的Na⁺净流量明显大于盐敏感型种源, 而K⁺外流的净流量小于盐敏感型种源。这表明NaCl胁迫引起沙枣幼苗Na⁺积累而K⁺流失, 但耐盐型沙枣种源幼苗根系具有更好的Na⁺外排能力和保留K⁺能力。

在高等植物中, 质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白除了负责调节根部Na⁺外排和体内Na⁺长距离运输外, 还可以调控细胞内的K⁺平衡、pH值和Ca²⁺信号转导 (马清等, 2011; 孙健, 2011)。质膜Na⁺/H⁺逆向转运体在盐胁迫下被诱导合成或者激活, 进而将Na⁺从细胞质外排到细胞外, 但是排Na⁺需要质膜两侧产生的H⁺电化学势梯度来完成, 而质膜H⁺-ATPase利用水解ATP产生的能量将H⁺泵出细胞质能形成H⁺电化学势梯度(Rausch et al., 1996; 陈观平等, 2006; 马清等, 2011)。同时, Olias等(2009)对番茄(Solanum lycopersicum)研究发现质膜Na⁺/H⁺逆向转运体(SlSOS1)不仅在NaCl胁迫下维持离子平衡起重要作用, 而且对于Na⁺在各器官间的区隔化也发挥关键作用。Cuin等(2011)研究认为Na⁺/H⁺逆向转运体可以作为小麦耐盐性筛选的一个量化指标。大量转基因试验证实质膜Na⁺/H⁺逆向转运体的转基因植物也都表现出更强的耐盐能力(Yang et al., 2009; Yue et al., 2012; Feki et al., 2014)。在本试验中, NaCl胁迫下, 沙枣幼苗根系Na⁺外排显著增加, 耐盐型沙枣种源的Na⁺外流速率大于盐敏感型种源, 并且瞬时盐胁迫下, H⁺由内流变为外流, 耐盐型种源沙枣幼苗根系的H⁺外流量明显大于盐敏感型种源, 说明耐盐型种源沙枣幼苗在盐胁迫下具有更强的Na⁺/H⁺逆向转运体和质膜H⁺-ATPase活性。本研究的药理学试验显示, Na⁺/H⁺逆向转运体抑制剂Amiloride显著减少Na⁺的外排, 并且阿拉尔种源在NaCl和NaCl+ Amiloride处理下Na⁺净外排量均显著高于银川种源, 这进一步表明质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白在沙枣根尖外排Na⁺过程中起着非常重要的作用, 但是两个种源在抑制量间无显著差异(449 pmol·cm^-2·s^-1和 429 pmol·cm^-2·s^-1), 并且在NaCl + TEA处理后两个种源根尖的Na⁺净流量也无明显差异, 这可能与抑制剂浓度, 处理时间和试验材料有关, 也可能沙枣的排Na⁺机制有其未知的特殊性,有待进一步研究探讨。

另外, 在NaCl胁迫下, 细胞去极化程度会加强, 由此促使通过外向K⁺通道和非选择性阳离子通道外流的K⁺增加(Chen et al., 2007a; Shabala & Cuin, 2008; Sun et al., 2009)。在本试验中, 在NaCl胁迫 24 h和瞬时NaCl胁迫后, K⁺外流量显著增加, 但受到K⁺通道抑制剂TEA的限制, 这与对大麦(Chen et al., 2007a)的研究结论相同。另外, 在TEA处理后, 两个种源间的K⁺外流差异不明显, 由此推测两个种源的K⁺外流在其他通道途径间无差异, 经K⁺通道而发生的K⁺外流是引起种源间K⁺外流和保持K⁺/Na⁺平衡能力差异的一个主要原因。

综上所述, 在NaCl胁迫环境下, 沙枣幼苗为了降低体内Na⁺的积累, 通过质膜Na⁺/H⁺逆向转运体将Na⁺排到细胞外, 同时, NaCl胁迫会使细胞去极化程度加强, 增加K⁺外流。阿拉尔种源的沙枣幼苗根系表现出更强的Na⁺/H⁺逆向转运体活性, 更多的Na⁺外排, 从而减少Na⁺向叶片组织的运输, 并减少NaCl胁迫下根系细胞中的K⁺外排, 进而更好地保持细胞质中K⁺/Na⁺平衡, 由此表现出更强的耐盐能力。

致谢 感谢温州市森林生态科技创新团队项目(C20150002)资助。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者声明没有竞争性利益冲突.

参考文献

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