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谷子及其根际土壤微生物群落对铬胁迫的响应机制

白雪, 李玉靖, 景秀清, 赵晓东, 畅莎莎, 荆韬羽, 刘晋汝, 赵鹏宇

植物生态学报 2023, 47 (3): 418-433. DOI: 10.17521/cjpe.2022.0049

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重金属铬(Cr)污染对农田中农作物产生毒害作用并破坏土壤微生物群落稳态, 但不同农作物及其根际土壤微生物群落对Cr胁迫的响应机制均有所差异。该研究在时间序列上分析Cr胁迫对谷子(正名: 粱, Setaria italica)长势、谷子差异表达基因(DEGs)的功能途径及土壤微生物群落结构和功能等方面的影响, 阐明谷子及土壤微生物群落的响应机制, 为Cr胁迫下的谷子生长及污染土壤的生态修复治理提供理论依据。基于室内盆栽实验, 以谷子幼苗和种植谷子的土壤为实验材料, 在Cr胁迫前(CK)及胁迫后6 h和6 d (Cr_6h、Cr_6d)的时间序列上分别进行样本采集, 同时测量幼苗生理性状指标及土壤理化指标。通过转录组分析, 研究Cr胁迫时间序列上谷子幼苗基因表达及所富集的功能途径的变化趋势; 通过高通量测序分析, 研究Cr胁迫时间序列上土壤微生物群落结构、物种多样性、群落功能的动态变化过程及与土壤理化性质的相关性。结果发现: 1)转录组分析结果表明Cr胁迫诱导基因表达上调(上调DEGs 54%); Gene Ontology (GO)富集分析表明DEGs在CK和Cr_6h、Cr_6h和Cr_6d样本对中与光合作用相关的基因的表达显著下调; 在Cr_6h和Cr_6d样本对中与防御和损伤调控相关的基因的表达显著上调, 细胞壁及细胞膜和细胞分裂相关基因的表达下调。2)高通量测序结果表明Cr胁迫时间序列上土壤细菌与真菌在门、属水平组成变化显著; 细菌群落α多样性呈现出由应激到稳定的阶段性变化特征(CK、Cr_6h和Cr_6d的Shannon多样性指数分别为6.09、5.93和6.05; Simpson多样性指数分别为0.006 8、0.007 8和0.006 8; Chao多样性指数分别为2 818.49、2 630.73和2 769.38), 而真菌群落α多样性显著下降(Shannon-Wiener多样性指数分别为4.17、3.81和3.23); 细菌与真菌群落的β多样性在Cr胁迫时间序列的分布差异显著。3)土壤理化性质与微生物群落相关性分析表明土壤理化因子与多种真菌群落显著相关, 而与细菌群落的关联关系较弱。结果表明Cr胁迫在时间序列上通过降低叶绿素含量、光系统活性并影响类囊体等结构组分显著抑制了谷子幼苗的光合作用过程, 通过下调细胞壁及微管相关组分基因表达抑制叶片细胞的增殖分化过程, 但同时激活了植物防御系统以降低自身所受的毒害作用。同时土壤细菌与真菌群落通过群落组成结构及多样性的变化来适应Cr胁迫, 二者在胁迫时间序列上的响应程度和策略均有所不同。

指标 Index	对照 Control	Cr胁迫6 h Cr stress for 6 h	Cr胁迫6 d Cr stress for 6 d
茎长 Stem length (cm)	5.86 ± 0.55^b	5.52 ± 0.55^b	7.73 ± 1.12^a
根长 Root length (cm)	4.18 ± 0.81^a	3.64 ± 0.23^a	3.83 ± 0.75^a
干质量 Dry mass (g)	0.003 1 ± 0.000 5^b	0.003 4 ± 0.000 5^b	0.005 0 ± 0.000 6^a
鲜质量 Fresh mass (g)	0.028 3 ± 0.005 3^b	0.029 4 ± 0.002 6^b	0.037 8 ± 0.005 1^a
叶绿素含量 Chlorophyll content (SPAD)	24.68 ± 1.70^a	18.84 ± 1.77^b	16.34 ± 2.00^b
氮含量 Nitrogen content (mg·g^-1)	7.49 ± 0.51^a	6.19 ± 0.52^b	5.45 ± 0.58^b

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表2 铬(Cr)胁迫时间序列上谷子长势及生物量测定(平均值±标准差)

正文中引用本图/表的段落

为定量分析基因的表达水平, 使用RSEM 1.3.3计算基因表达值, 定量指标为TPM (transcripts per million), 通过对基因长度和测序深度进行均一化处理, 使不同样本中总表达量一致, 直观观测基因间的表达量差异。采用Blast 2.9.0软件将基因与Gene Ontology (GO)数据库进行比对, 获得差异表达基因(DEGs)的注释信息。GO注释分析根据功能不同可分为分子功能(molecular_function, MF)、细胞组成(cellular_component, CC)和生物过程(biological_process, BP) 三大类, 并通过GO富集分析进行进一步的功能富集分析, 以明确植物幼苗受到调控的具体功能类别。采用DESeq2 1.24.0软件, 通过多次检查和校正将Cr胁迫下样品(Cr_6h、Cr_6d)与对照样本(CK)进行比较, 并以p < 0.01且|log₂FC| ≥ 2 (FC, 差异表达倍数)作为筛选DEGs的阈值。

用软件R 4.1.2、SPSS 19.0及Excel 2010辅助数据分析与作图。利用单因素方差分析(ANOVA)评估Cr胁迫时间序列上土壤理化因子、植物生理指标及生物量、土壤中细菌与真菌群落的物种组成、多样性等; 通过火山图明确Cr胁迫时间序列上DEGs的上下调状况; 通过GO功能注释与富集分析明确DEGs功能表达差异; 利用Sobs指数、Shannon多样性指数等探究土壤微生物群落的α多样性; 利用非度量多维尺度分析(NMDS)对Cr胁迫后时间序列上土壤微生物群落的时空分布格局进行排序分析; 利用PICRUSt 2、FUNGuild功能预测, 划分对环境资源吸收与利用相似的类群。

通过测量植物茎长、根长、干质量、鲜质量、叶绿素含量、N含量分析Cr胁迫在时间序列上对谷子长势的影响(图1)。结果表明Cr_6d与Cr_6h相比, 植株的茎长、干质量、鲜质量分别显著增加了40.04%、47.06%、28.57%, 根长无显著变化; 而与CK相比, Cr_6h叶绿素与N含量分别显著下降23.66%、17.36% (表2)。

Venn图(图4A、4B)分析表明, 细菌中共检测出2 763个共有OTUs (占所有OTUs的78.74%), CK、Cr_6h和Cr_6d阶段特有OTUs分别为81 (2.31%)、24 (0.68%)、69 (1.97%); 真菌中共检测出578个共有OTUs (占所有OTUs的44.33%), CK、Cr_6h和Cr_6d阶段特有OTUs分别为170 (13.04%)、155 (11.89%)和118 (9.05%)。

另外, Cr胁迫抑制了叶片中光合作用相关基因的表达。根据表2, 随Cr胁迫时间增长谷子叶片中叶绿素含量显著下降, 且GO富集分析表明在CK和Cr_6d样本对中的光合作用光反应与暗反应、光系统I与光系统II等基因表达均显著下调。可能在于Cr可降解参与叶绿素生物合成的重要酶——氨基乙酰丙酸脱水酶, 降低了细胞中的叶绿素水平(Vajpayee et al., 2001), 与Cr处理小麦中叶绿素含量降低的结果(Subrahmanyam, 2008)相一致。同时Cr毒性抑制光系统中的光合成复合物、影响电子传递效率、降低光系统II (PSII)反应中心的活性并导致PSII的异质性即结构与功能多样性的变化(Mathur et al., 2016)。且GO富集分析表明3组样本对中类囊体膜、质体类囊体膜等基因表达均显著下调, 可能在于Cr(VI)毒性引起类囊体畸变, 对光合作用产生负面影响使细胞内能量转移失衡(Ali et al., 2013)。光合作用相关组分基因表达下调降低了光合作用效率, 影响了植物细胞中营养物质的吸收及转运, 最终可能抑制谷子叶片的生物量及植株生长。

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